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La segregazione temporale dei processi biosintetici è responsabile delle oscillazioni metaboliche durante il ciclo cellulare del lievito in erba

Oct 18, 2023Oct 18, 2023

Nature Metabolism volume 5, pagine 294–313 (2023) Citare questo articolo

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Sono stati identificati molti meccanismi biologici e biochimici cellulari che controllano il processo fondamentale della divisione cellulare eucariotica; tuttavia, la dinamica temporale dei processi biosintetici durante il ciclo di divisione cellulare è ancora sfuggente. Qui, mostriamo che i processi biosintetici chiave sono temporaneamente segregati lungo il ciclo cellulare. Utilizzando il lievito in erba come modello e metodi unicellulari per misurare dinamicamente l'attività metabolica, osserviamo due picchi nella sintesi proteica, nelle fasi G1 e S/G2/M, mentre la sintesi di lipidi e polisaccaridi raggiunge un solo picco, durante la fase S/G2. Fase /M. Integrando i tassi biosintetici dedotti in un modello metabolico termodinamico-stechiometrico, scopriamo che questa segregazione temporale nei processi biosintetici provoca cambiamenti di flusso nel metabolismo primario, con un'accelerazione del flusso di assorbimento del glucosio in G1 e oscillazioni sfasate degli scambi di ossigeno e anidride carbonica . Attraverso la validazione sperimentale delle previsioni del modello, dimostriamo che il metabolismo primario oscilla con la periodicità del ciclo cellulare per soddisfare le mutevoli richieste dei processi biosintetici che mostrano dinamiche inaspettate durante il ciclo cellulare.

La crescita e la divisione cellulare sono processi biologici fondamentali. Mentre disponiamo di una solida conoscenza dei meccanismi biologici e biochimici cellulari che controllano il ciclo di divisione cellulare, sappiamo molto meno delle dinamiche temporali della biosintesi e del metabolismo primario che guidano la crescita cellulare durante il ciclo cellulare. Mentre è noto che la biosintesi del DNA è temporalmente limitata all'interno della fase S, le dinamiche di altri importanti processi biosintetici, come la sintesi di proteine ​​e lipidi, rimangono poco chiare; i processi biosintetici sono costantemente attivi durante l'intero ciclo cellulare? Se le loro attività cambiano, la velocità dei diversi processi biosintetici cambia nello stesso modo? Tale conoscenza è essenziale per scoprire i meccanismi alla base della regolazione della crescita cellulare, i cui difetti sono associati alla malattia1,2.

Attualmente, si ritiene che la sintesi proteica aumenti con un tasso esponenziale o costante durante tutto il ciclo cellulare del lievito, come determinato da studi a livello di popolazione con marcatura radioattiva3,4,5 e analisi di singole cellule6,7. Recentemente, tuttavia, abbiamo scoperto che il tasso di produzione della proteina fluorescente verde (GFP) controllata dal promotore endogeno TEF1 raggiunge il picco in G1 (rif. 8), suggerendo che l'attività biosintetica delle proteine ​​potrebbe effettivamente essere non monotona durante il ciclo cellulare. Questa scoperta sarebbe coerente con un picco osservato di abbondanza di proteine ​​ribosomiali in G1 (rif. 9), sebbene altri non abbiano trovato tale dinamica10. Allo stesso modo, è stato osservato anche il picco dell'espressione di geni associati alla biogenesi e alla traduzione dei ribosomi in G1 (rif. 10,11); tuttavia, gli studi di sequenziamento dell'RNA su singola cellula (RNA-seq) hanno riportato solo un piccolo aumento dell'mRNA della proteina ribosomiale in G1 (rif. 12) o nessuna differenza notevole nel ciclo cellulare13. Come per altre classi di macromolecole, come i lipidi e gli acidi nucleici, anche secondo recenti studi multi-omici è stato suggerito che la loro biosintesi accelera durante alcune fasi del ciclo cellulare. Tuttavia, le abbondanze molecolari misurate in questi studi forniscono solo prove indirette dei tassi biosintetici effettivi. Pertanto, la dinamica temporale delle attività biosintetiche durante il ciclo cellulare è ancora in gran parte sfuggente. Rispondere a questa domanda richiederà probabilmente la misurazione dei tassi in modo dinamico, risolto in base al ciclo cellulare, il che finora pone enormi sfide tecniche.

Qui, utilizzando il lievito in erba come modello e impiegando la microscopia a fluorescenza dinamica a cellula singola con un nuovo metodo stop-and-respond, abbiamo scoperto che le attività della biosintesi di proteine, lipidi e polisaccaridi non sono né esponenziali né costanti durante il ciclo cellulare. Nello specifico, abbiamo scoperto che la biosintesi proteica presenta due ondate di attività per ciclo cellulare, mentre le attività della biosintesi dei lipidi e dei polisaccaridi sono basse durante la prima ondata di biosintesi proteica in G1 ma elevate durante la seconda ondata in S/G2/M. Abbiamo convertito i modelli scoperti delle attività biosintetiche in unità assolute tramite un modello matematico della dinamica della massa cellulare, li abbiamo integrati in un modello metabolico termodinamico-stechiometrico e quindi abbiamo dedotto la dinamica del ciclo cellulare dei flussi metabolici primari. Poiché abbiamo potuto convalidare sperimentalmente i cambiamenti del flusso metabolico dedotti, ciò ha fornito ulteriori prove per i modelli dinamici scoperti delle attività biosintetiche e ci ha anche permesso di concludere che la segregazione temporale nei processi biosintetici deve essere responsabile delle oscillazioni su scala oraria nel metabolismo primario . Il nostro lavoro mostra che la crescita cellulare durante il ciclo cellulare è un aggregato di processi biosintetici e metabolici primari temporalmente separati, che fornisce informazioni fondamentali sulle basi della fisiologia cellulare.

threefold change) and respective cell growth rates (>11-fold change), which are larger spreads than those during the cell cycle (~1.4-fold change of dry mass and ~1.6-fold change of dry mass derivative, as estimated from our data). The changes in protein synthesis rate during the cell cycle that we report here could thus be well hidden in the noise of the cell mass/growth rate data from the other work57. Moreover, cellular composition changes during the cell cycle could potentially confound a direct comparison of the buoyant-mass data57 with our dry-mass-related data (as shown in formula 1 in recent work58). The authors of the paper57 have cautiously not made any conclusion on cell-cycle dynamics of cell growth rate in yeast./p> \Delta \bar t_{\mathrm{START}} \cap E^c = {\mathrm{ME}}\), \(\varphi ^c > \Delta \bar t_{\mathrm{BUD}} \cap E^c = {\mathrm{START}}\) or \(\varphi ^c > \Delta \bar t_{CC} \cap E^c = {\mathrm{BUD}}\). Therefore, we arrived to a smaller or the same set of cells \(S2,\left| {S2} \right| \le \left| {S1} \right|,\) for which we associated the NAD(P)H derivative value Pc with the position in cell cycle φc when perturbation happened. Besides, for each cell \(c \in S2\), we stored the information about the kind of the cell-cycle event closest to perturbation, Ec./p> \overline {F_i} \left( {15 \times 15} \right) + p30\), where Fi is the pixel’s intensity, \(\overline {F_i} \left( {15 \times 15} \right)\) – the mean intensity among the nearest 15 × 15 pixels (roughly, a third of the mother cell) and p30 – the thirtieth percentile among the mother cell’s pixels (Python’s method skimage.filters.threshold_local with block_size = 15, method = ‘mean’, offset = p30 and mode = ‘nearest’). Using the offset p30 helps to discard a small number of cytoplasmic pixels that due to noise happen to be brighter than their neighbors. For the same purpose, after the local thresholding, we removed objects (ensembles of selected pixels) smaller than 25 pixels and having the connectivity equal to 1 (two pixels are connected by one orthogonal step). Eventually, we segmented one object containing the brightest pixels, which represents nucleus. If some pixels inside this object were not selected in the local thresholding (due to noise, some single pixels may be dimmer), then we added these pixels to the selection. To calculate the abundance of the fusion Hta2-mRFP in the mother-cell nucleus, we summed the intensities of the pixels located within the segmented nucleus. Microscopy image processing was performed in Python with the help of the module skimage./p> 0\), where Sij is the coefficient of j = ATP in the reaction i that has the flux \(v_i^{\mathrm{cell}}\left( t \right)\) (mol cell−1 h−1) (due to the steady-state assumption of FBA, the turnover values would be the same if ATP-depletion fluxes only were summed). We showed individual reactions i whose cytoplasmic flux of j = ATP calculated as \(S_{ij}\,v_i^{\mathrm{cell}}\left( t \right)\) is bigger than 0.09 or smaller than −0.09 (mol cell−1 h−1) in at least one cell-cycle phase. In Fig. 4d, for each precursor, we calculated the sum of its fluxes, \(\mathop {\sum}\nolimits_i {S_{ij}v_i^{\mathrm{cell}}(t)}\), in the reactions diverting from central metabolic pathways to the synthesis of major biomass components: for ribose 5-phosphate (r5p), its fluxes in the syntheses of AMP, GMP and UMP as well as phosphoribosyl pyrophosphate; for erythrose 4-phosphate (e4p), its flux in the synthesis of 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate; for phosphoenolpyruvate (pep), its fluxes in the reactions of 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthetase and 3-phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase; for pyruvate (pyr), the l-alanine flux in the reaction of protein biosynthesis; for acetyl-CoA (accoa), its fluxes in the reactions of zymosterol synthesis, homoserine O-trans-acetylase, 2-isopropylmalate synthase and lipid biosynthesis; for glycerol 3-phosphate (g3p), its flux in lipid biosynthesis; for glucose 6-phosphate (g6p), its fluxes in polysaccharide and lipid biosynthesis; for fructose 6-phosphate (f6p), its flux in polysaccharide biosynthesis./p>

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